利用 QIAGEN IPA 找出台灣人圓禿病的關鍵基因與機制
QIAGEN Ingenuity Pathway Analysis (IPA) 是生命科學研究領域領先的路徑分析軟體，其提供了建立和分析交互作用網路和路徑的功能，從而有助於更深入地理解分子之間的作用和調節機制。在分析過程中，透過基因和交互作用網路的探索，IPA能夠預測可能涉及的疾病和功能，為進一步的研究提供指引。此外，IPA還通過視覺化的方式展示分析結果，有助於更清晰地解釋複雜的研究成果。總體而言，IPA的系統性資料分析功能有助於深化對特定分子間交互作用及其在病理過程中的潛在作用的理解，為研究提供了新的方向。
簡介
圓禿病(AA)，俗稱：鬼剃頭，是台灣最常見的自體免疫性脫髮疾病之一，發病率為0.22%。AA的主要症狀是快速、非疤痕性的脫髮，影響身體毛髮、面部毛髮、睫毛和眉毛。在美國，AA的盛行率估計為每年1,000人中約有0.21人，平均發病年齡為25至36歲，並且沒有性別差異。在英國的結果相似，盛行率是每年1,000人中約有0.26人，平均發病年齡在25至29歲之間，也沒有顯著的性別變異。不同種族中，特別是亞洲人中，AA的病例多為女性，且其發病率遠高於西方人群，達到每年1,000人中約有3.32人。AA可能與數種因素有關，包括服用卡馬西平、苯妥英或穀胱苷其等藥物後產生的不良反應、病毒或細菌感染，以及壓力、吸煙和酗酒等心理因素。AA患者常常伴有心理疾病，如抑鬱症、焦慮症和社交恐懼症。
圓禿病變的主要原因包括髮周期顯著縮短、皮膚或頭髮的局部微創傷，以及一類主要組織相容性複合體(HLA)分子(HLA-A、HLA-B、HLA-C)和二類HLA分子(HLA-DP、HLA-DQ、HLA-DR、HLA-DN、HLA-DO)的異常表達。雖然AA並不具有傳染性，但經常觀察到會在家族內發生。主要原因是6號染色體上的遺傳變異，也有來自10號、16號和18號染色體的遺傳變異。研究顯示，AA的發生與遺傳有關，可能在家族內傳人。然而，台灣AA的遺傳基礎尚未被明確地研究。此研究利用中國醫藥大學附設醫院的台灣基因庫，我們對AA患者的基因變異進行了全基因組關聯研究。根據我們的研究結果，台灣患者的基因多樣性與其他種族有明顯的區別。
研究方法
此研究收集從1992年到2020年電子病歷中的臨床資訊，針對經過專業醫師驗證並確診為圓禿病的個案，並排除患有自體免疫疾病的病患，最終得到408個圓禿病的案例以及8,167個對照案例；其採用TPMv1定製SNP陣列進行全基因組關聯研究(GWAS)分析瞭解SNP陣列與圓禿風險的關聯。
同時將所有的變異點相關資訊，輸入到IPA軟體之中，根據Risk loci而建立了一個對應882個與圓禿有關的SNP基因座的基因交互作用網路。此外，也使用HIBAG-R來計算每位研究參與者的HLA類型。HLA的單倍體和雙倍體與斑禿發生的關聯性由卡方統計分析，並透過Bonferroni校正進行多重檢驗。
結果
本研究使用408名病例和8,167名對照進行GWAS分析。對照組中有3,311名男性和4,856名女性，平均年齡為37.49±15.32歲(表1)。 AA組中的166名男性和242名女性平均年齡為37.49±15.57歲。研究並未觀察到基於性別、年齡、吸煙、飲酒或嚼檳榔的臨床特徵有顯著差異。 GWAS調查的結果顯示，與AA有關的882個SNP位於14,064,987的位置。表2列出與AA最相關的前15個SNP。有六個SNP和一個單核苷酸變異（SNV）在3和5號染色體上與AA有關。這些SNP和SNV包括LINC02006（rs531166736， rs187306735）、APC（rs112800832_C_CAT）、SRP19（rs139948960，rs144784670）、EGFLAM（rs16903975）和LDLRAD3（rs79874564）。統計學上的顯著性由p值小於5E-08表示。此外，rs397081和rs9273067的區域圖顯示比其他SNP更高的連鎖不平衡度（圖3）。在AA組中，NOTCH4（圖3A）和HLA-DQA1（圖3B）的變異也具有高度相關性（LD得分r r2 >0.4）。結果顯示這些位點可能共享功能、途徑或疾病相關性。
表1. AA 研究參與者的分類分群
表2. AA 病中 SNP 的基因組位置 (p<1E-07)
圖1. 通過曼哈頓圖分析確定了全基因組變異與AA的關係。在曼哈頓圖分析中，通過質量控制的SNP根據其染色體位置繪製在X軸上，與Y軸（-log10 p值）繪製。較高的實線表示全基因組顯著性標準 (P<5E-8)。
IPA分析結果
作者使用IPA軟體進行了882個與圓禿病相關的SNPs（P<1E-05）在74個基因內的全基因組的影響分析。結果顯示，導致圓禿病的典型途徑包括抗原呈現途徑，Th1和Th2相關途徑，PD-1/PD-L1癌症免疫治療途徑，與多種相關路徑（表3）。並且，根據基因數量與途徑的交叉分析結果，排列了細胞免疫反應，體液免疫反應，細胞增長/增殖和發育，細胞因子信號和病原體影響信號（圖2）。請參閱我們的結果中的抗原呈現途徑（圖3A）和Notch信號靶基因（圖3B）。
圖2. 與圓禿病相關的 882 個 SNP 基因位置的網路相關分析。
圖3. IPA的網路分析與結果呈現。(A) 抗原表現途徑的標靶基因 (B) Notch信息傳遞路徑的標靶基因。
作者確定了幾個HLA相關基因位點作為圓禿病中SNPs的主要基因體位置：HLA-DQA1（rs9272328, rs9273067），HLA-DRA（rs3129871, rs6911777, rs16822618），HLA-DRB1（rs9270498, rs9270502, rs9270523），以及antigen presentation with Th1/Th2 activation中的Notch4-mediated T cells activation signaling（rs379464, rs2854048, rs367398, rs397081, rs3134928）。此外，GWAS結果還發現一些與特定皮膚和毛髮狀態相關的相關基因標記，包括澱粉樣斑色變病（genomic markers: GPNMB），常染色體顯性的Hailey-Hailey病（genomic markers: ATP2C1），皮膚色素沉著病（genomic markers: GPNMB, ANKRD12, MC1R），皮膚和毛髮色素過淺（genomic markers: MC1R），和逐漸性脫髮（genomic markers: ABCE8）。另外，GWAS結果還識別出九個與圓禿病的IFN-γ-JAK-STAT信號傳導途徑相關的基因標記，包括HLA-DRA，HLA-DRB1，HLA-DQA1，LIFR，ANKS1A，SEC11A，USP6NL，SLC16A9和UBE4B（圖4）。
表3. 前25名與圓禿病相關的生物典型路徑與相關基因
圖4. IPA軟體分析網路分析。(A)與皮膚和毛髮疾病相關的遺傳標記。(B) 與IFN-γ-JAK-STAT訊號傳遞路徑相關的九個遺傳標記。
結論
研究結果顯示，自體免疫疾病中的AA訊號傳導的病原機制是至關重要的（圖5），此為利用全基因組關聯研究 (GWAS)，首次在台灣人中發現了許多與AA有關的基因座位置，並且能利用IPA網路分析軟體，進一步找出AA的訊號傳導途徑，證實了基於GWAS得出的遺傳研究結果。而未來研究將可進行功能驗證，以區分病原變異與非病原變異。
圖5. 圓禿病的分子機制
參考文獻
Genome-Wide Association Study of Alopecia Areata in Taiwan | CCID (dovepress.com)